化学进化是如何获得2018年诺贝尔化学奖的

今年早些时候，弗朗西斯·阿诺德告诉我们“大自然是有史以来最好的化学家”。你只要看看生命的多样性就能明白她的意思。数十亿年来，进化产生了几乎无穷无尽的分子、反应和化学途径，帮助生物栖息在地球上的几乎每一个角落。

的三位今年的诺贝尔化学奖获得者正如诺贝尔奖委员会所说，他们在分子水平上“利用了进化的力量”。阿诺德他在酶的定向进化方面的工作创造了具有全新化学物质的生物系统，并使生物催化剂的生产成为更环保的化学制造。她获得奖金的50%，剩下的一半由两人分享乔治·史密斯而且格雷格冬天他们在噬菌体展示方面的开创性工作，这是一种进化新蛋白质和抗体的方法，最终导致了药物的开发，改善了数百万人的生活。

他说，正是定向进化策略在各个科学学科中所产生的“广泛而深刻的影响”，使其值得获得诺贝尔奖鲁迪Fasan他曾是阿诺德的博士后，现在在美国罗切斯特大学经营着自己的实验室。“它们彻底改变了我们的思维方式，”他说必威体育 红利账户．

噬菌体的年龄

早在20世纪80年代，乔治·史密斯并不知道他的工作最终会导致医学的进步。

他在美国密苏里大学(University of Missouri)担任名誉教授，在诺贝尔奖宣布后的新闻发布会上说:“我当时的视野非常狭隘。”“我一直在寻找一种更简单的方法，可以在庞大的蛋白质库中搜索与抗体结合的蛋白质。他极力强调，他的发现在很大程度上依赖于之前的工作。“我碰巧在正确的时间出现在正确的地点。”

那个地方是生物化学家的实验室罗伯特•韦伯斯特在美国北卡罗来纳州的杜克大学，他利用密苏里州的公休时间在那里工作了两年。当时，研究人员已经成功地建立了大量随机肽和蛋白质的库，但在这些库中寻找具有所需活性的蛋白质——例如与特定抗体或靶标结合——是缓慢而费力的，因为每个分子都必须单独筛选。将特定蛋白质与编码它们的基因序列联系起来也很困难。

我碰巧在正确的时间出现在正确的地点

乔治·史密斯

史密斯利用丝状噬菌体克服了这些障碍。丝状噬菌体是一种感染细菌的病毒，其简单的生理机能已经得到了很好的研究。噬菌体由一层蛋白质外壳包裹着的遗传物质组成——噬菌体将自己的基因插入细菌的DNA中，从而复制出更多的噬菌体。

他证明，如果一个基因片段被插入到噬菌体的DNA中，在复制过程中，它会被复制，它编码的肽或蛋白质最终会“显示”在噬菌体表面，因此该技术得名。他的推理是，你可以在噬菌体的混合物中搜索，并“找出”那些携带一种蛋白质，能与特定目标强烈结合的噬菌体。因为噬菌体包含原始的基因序列，这也是一种为感兴趣的蛋白质识别未知基因的方法。

1985年，Smith首次证明了这一点，他将一个57个氨基酸的限制性内切酶长片段插入到丝状噬菌体基因组III基因中，该基因编码其中一种外壳蛋白。他展示了一种与肽片段结合的抗体，可以用来从其他噬菌体中捕获含有外源肽的噬菌体。¹在接下来的几年里，他改进了这种方法，并证明反复的噬菌体展示可以用来选择对抗体目标具有最高结合亲和力的蛋白质。²

史密斯在新闻发布会上说:“噬菌体展示可以让你创造出拥有100亿或1000亿个结构的巨大克隆库，而不必一次搜索几个月，你可以开发出一种选择的方法，物理地抽出你想要的，这样你就可以扔掉其他的。”

保罗Dalby英国伦敦大学学院生物化学工程教授史密斯记得，上世纪90年代末，他在费城大学(University of Philadelphia)担任博士后研究员，从事噬菌体展示项目时使用了史密斯开发的方法。

他回忆说:“我拿到的第一件东西是一份乔治·史密斯(George Smith)的协议记录——那是他实验室里复印的复印件的复印件。”“这有点像噬菌体展示的圣经——每个人都开始使用这种技术。”

这项技术很快被其他研究蛋白质的小组采用，并开始向新的方向发展。与此同时，史密斯自己的研究在20世纪90年代从噬菌体展示转向了噬菌体展示，大约在他首次展示噬菌体展示十年之后。那时他还不知道他的贡献最终会产生什么样的影响。

达尔比说:“史密斯克服了许多技术障碍，使这个系统得以运行。”“但它最初只是一种显示蛋白质和筛选肽的技术。”

正是温特在英国剑桥分子生物学实验室的工作，使噬菌体展示开启了药物开发的革命。

大自然的防御

温特说:“我不知道抗体有多可信——对制药业来说，药物就是化学物质、小分子。”“但我认为这是个好主意——它们是我们抵御病毒、细菌和病原体的正常途径，那么为什么我们不能用它们来对抗癌症呢?””

史密斯早期的工作集中在操纵酶的结构上。但他的兴趣转向了抗体在乔治Köhler和César米尔斯坦1984年，他因开发出由基因相同的免疫细胞产生的单克隆抗体而获得诺贝尔医学奖。

他知道所有的抗体都具有相同的基本结构，在与不同靶标结合的位点上存在相对较小的差异。几年来，他的工作重点是利用这个“支架”来设计新的蛋白质。正是这种对抗体结构的了解，最终使他能够应用噬菌体展示的原理。当时，还没有人在噬菌体表面显示出像抗体这样复杂的东西——它包含一个以上的多肽链，所以温特用该序列提取了包含其结合区域的抗体片段。这意味着抗体的结合位点将显示在噬菌体的表面，当该序列被插入到噬菌体的一个外壳蛋白的基因时，可以使用结合靶标(一种称为phOx的分子)将其提取出来，这与史密斯最初的实验有某种逆转:抗体的一部分在噬菌体上，选择由靶标完成。温特在1990年证明了这是可行的，实现了有史以来第一次噬菌体展示折叠和功能齐全的抗体片段。^3.

就像蛋白质一样，这为创建巨大的抗体库铺平了道路，温特继续表明，噬菌体展示可以用来进化出对目标具有比传统免疫方法获得的抗体更高的结合亲和力的抗体，使用重复的突变和选择来开发高亲和力抗体，保留其对目标的特异性。⁴

他和同事们一起成立了一家分拆出来的公司——剑桥抗体技术公司(CAT)，专注于抗体治疗。经过整个20世纪90年代的开发，世界上第一个基于人单克隆抗体的药物-抗(阿达木单抗)- 2002年获批。

新疗法

Humira结合并抑制肿瘤坏死因子α (TNF-α)，这是一种细胞信号蛋白，可促进与自身免疫性疾病相关的炎症。它最初是用来治疗类风湿性关节炎的，但后来被批准用于治疗包括克罗恩病、牛皮癣和强直性脊柱炎在内的多种自身免疫性疾病，成为世界上最畅销的药物，2017年实现了近185亿美元(140亿英镑)的收入。

抗体的优势在于它们有一种结构，使它们非常易于改变

格雷格冬天

“Humira的开发将一种基于实验室的技术转变为一种被接受的药物开发技术，”简·奥斯伯恩(Jane Osbourn)说。她自上世纪90年代初就在CAT工作，现在是其继任者MedImmune的研发副总裁，该公司隶属于阿斯利康(AstraZeneca)。“它确确实实在之前持怀疑态度的群体中确立了抗体作为治疗手段的声誉。””She says Winter was ‘an enormous presence in CAT’s early days – a brilliant, science-focused and inquisitive leader. He was always tracking the latest developments and inspiring us all to do more.’

今天，噬菌体展示被广泛应用于制药和生物技术领域，有许多抗体疗法可供患者使用或在临床试验中使用。“这项技术可以应用于任何疾病，从肿瘤学到哮喘再到糖尿病等等。奥斯本说:“这让我们了解到，我们有可能制造出针对任何蛋白质的抗体。”

温特说，在未来，研究人员将继续产生具有额外功能的更奇特的抗体片段。“抗体的优势在于它们有一种结构，使它们非常易于改变。他们有很多域名，所以很容易再加一个。”

他说，特别是双特异性抗体的出现，那些能够结合两个治疗靶点的抗体是令人兴奋的。双特异性可以将两种类型的细胞结合在一起，所以你可以将t细胞带到任何特定的目标，我们已经看到了这些。最近一个非常有趣的应用是(罗氏的)双特异性Hemlibra它模仿凝血疾病患者体内的因子VIII。我认为在很多情况下，我们都可以制造出模仿天然蛋白质的抗体。”

进化酶

虽然噬菌体展示的发明让研究人员能够生产新的蛋白质和抗体，但阿诺德在20世纪90年代的工作表明，你可以进化出一种酶。

“在那之前，你可以使用噬菌体展示来制造结合抗体或目标的东西的变体，但我们不能把同样的技术应用到酶上，这样它们就能更好地催化反应，”达尔比说。他在20世纪90年代花了很多时间试图让噬菌体展示适应酶。他解释说，这是因为酶的活性是由一些特征决定的，这些特征是用噬菌体展示无法发现的，比如它在一秒钟内转化了多少底物。“弗朗西丝·阿诺德提出了一种使用相同概念的平行技术。她开创了这个新领域，迅速发展起来。”

阿诺德并不是作为分子生物学家开始她的职业生涯的。毕业后，她成为了一名机械和航空航天工程师，在把注意力转向蛋白质之前，她一直在设计太阳能设施。起初，她对理性设计感兴趣——试图直接重建蛋白质的结构，使它们具有不同的功能。她形容自己“幸福地不知道”这会带来的挑战。

“我没有意识到设计更好的蛋白质会有多么困难。这是DNA革命的开始，我们刚刚开始学习如何为人类目的操纵DNA和生命密码，但我们不了解规则，”阿诺德说必威体育 红利账户．她开始考虑进化的方法——这是德国生物化学家提出的理论曼弗雷德特征她说，在20世纪80年代，当“绝望袭来”时，她从未成功地展示过。

阿诺德说:“在我看来，很明显，你可以通过随机突变来避免对序列编码功能的无知，并让系统告诉你规则是什么。”“这个时机很合适，因为方法就在那里——杰里·乔伊斯已经出版了易出错PCR方法学这对突变非常有用，新的筛选能力已经成为可能，所以我可以在通常检测一种酶的时间内检测数百种酶。”

我们发现了有益的突变，可以提高离活性位点20-30Å远的酶活性

弗朗西斯·阿诺德

在酶的定向进化的第一个演示中，阿诺德开发了一种酶枯草杆菌素E，它能够在与它所适应的环境非常不同的环境中工作——在有机溶剂存在的情况下。她使用了一种聚合酶链式反应(PCR)，将随机突变引入到酶的基因序列中，并测试了数千种变体，以测试它们在35%的二甲基甲酰胺溶液中分解酪蛋白的能力，选择最有效的，并让它们进行进一步的突变和选择。在三代的时间里，她发现了一个有10个突变的枯草菌素版本，它在DMF中的效果是原来的250倍。⁵

阿诺德几乎立刻意识到她在做一些特别的事情。“我知道这很重要，(因为)带来好处的突变令人惊讶。她说:“人们提出的所有关于如何设计蛋白质的所谓规则都不能解释蛋白质认为它应该如何被设计。”“例如，我们发现了有益的突变，可以提高远离活性位点20-30Å的酶活性，或者稳定蛋白质表面的突变。”现在看来这是显而易见的，但当时并非如此。”

一种新型催化剂

阿诺德继续表明，酶的各种性质——包括它们发挥最佳作用的温度、它们的稳定性或它们对特定底物的催化活性——可以通过在自然进化过程中发生的加速过程来改变:通过引入基因突变在“母体”酶中产生变异，通过筛选选择最有效的“后代”，并重复这一过程。

法桑说，阿诺德最初的方法在技术上很容易实现，这意味着其他研究人员很快就采用定向进化来改变各种酶。他说:“从那时起，这些技术在许多方面得到了进一步发展，并用于解决其他类型的问题，例如使酶能够识别非原生底物和/或在特定化学转化的背景下提高其化学、区域和/或立体选择性。”他说，一个迅速变得重要的领域是使用进化酶来合成药物。到目前为止，实验室进化的酶已被用来代替工业催化剂，在生产降胆固醇药物的过程中产生中间体立普妥(阿托伐他汀)和降糖药Januvia例如西格列汀。

Fasan说:“西格列汀的案例尤其令人印象深刻。”“一种包括实验室进化的转氨酶的生物催化工艺可以取代一种成熟的化学催化工艺，用于制备这种药物的关键中间体，大大提高了生产率，同时减少了与整个工艺相关的浪费，并消除了有毒金属的使用。”

绿色机器

让阿诺德自己特别兴奋的一个领域是在绿色化学中使用进化酶。她说:“我想制造一种酶，这种酶可以进行有用的化学反应，而目前这种化学反应是以一种不可持续的方式进行的。”“我的想法来自人类发明的化学。我看着人们用铱或铑做了什么，我说，“如果我训练得好，一个生物系统能做到吗?”答案是肯定的——很多这种化学反应可以在DNA中编码。”

回到她最初的雄心，研究可再生能源，阿诺德已经开发出了生物催化剂，可以使微生物将单糖转化为潜在的生物燃料，如异丁醇，直接在生物合成途径中进化两种酶，以使用正常代谢的副产物大肠杆菌作为辅助因子。⁶

这种化学反应是可能的，也许酶是最有效的方法

弗朗西斯·阿诺德

在最近的一项成为世界头条新闻的进展中，她的团队最近成功地制造出了第一种可以催化碳硅键形成的酶，这种反应在自然界中从未见过。为了做到这一点，他们从温泉细菌进化出了细胞色素cRhodothermus绿,它能够催化碳硅键形成反应，但不是其主要功能，而且效率极低。经过几轮有针对性的诱变和选择，这种酶催化碳烯插入硅氢键的效果比起始酶好40倍，令人兴奋的是，在同样的反应中，它的效率比最知名的合成催化剂要高得多。⁷

通过微调酶来催化新的反应，阿诺德希望我们最终能看到一个未来，传统的化工厂已经被生物催化微生物所取代，能够以可持续的方式进行工业过程，没有重金属。

“在过去的几年里，我的团队已经证明，简单的，地球上丰富的铁(在酶中)可以催化人们以前只能用铱催化的反应。这对我们所有人来说都很棒，因为它向我们展示了这种化学反应是可能的，甚至可能酶是最有效的方式。”

理性遇到随机

定向进化绝不局限于自然界中存在的酶。研究人员开始证明，它可以与用于从头开始设计全新蛋白质和酶的计算方法相结合。

“计算已经取得了很大的进步，特别是在蛋白质的设计方面，但功能仍然很困难，这就是进化真正帮助我们的地方，因为它可以带我们越过终点线，”他说唐纳德Hilvert苏黎世瑞士联邦理工学院的教授，他的团队与计算蛋白质设计师合作，比如大卫•贝克在美国西雅图的华盛顿大学，他创造了一种生物催化剂，可以进行自然界中没有的有用反应，包括醛醇缩合和4+2环加成。⁸

希尔弗特说:“这种计算方法为我们迈出了第一步，但其活性远低于一种非常活跃的天然酶。”“我们应用了反复的诱变和筛选来优化它们的特性。在某些情况下，我们可以将启动活动提高五个数量级。我们在进化过程中经常会发现，原始的设计可能会被更有效的东西所取代，所以进化在告诉我们如何完成一项特定的任务方面是相当有创意的。”

我想做我的工作，但我也想支持年轻人的科学研究

弗朗西斯·阿诺德

他说，高通量筛选测定加快了选择过程，以及酶最初如何突变的进展进一步推动了该领域的发展。“你可以完全随机地做事情，也可以把注意力集中在蛋白质的特定区域。你可以随机选择蛋白质中某个氨基酸的活性位点或特定区域。”

Hilvert相信，进一步的技术进步将为酶的设计带来更多的改进。“设计新材料和新催化剂有巨大的机会。我认为我们才刚刚开始。”

阿诺德认为，我们甚至还没有接近定向进化所能达到的极限。在获得诺贝尔奖后，她渴望继续领导她的研究小组，尽管她也希望获奖的关注能激励有前途的研究人员采用她实验室的一些技术。她说:“我喜欢做我的工作，但我也想支持年轻人的科学研究，现在我可以用积极的方式来做这件事。”“有很多年轻的化学教授认为这是一条非常有趣的道路，他们的创造力将导致一些非常有趣的转变。”