决心革命

俗话说，眼见为实。欣赏每一种生物都是由细胞和分子组成是一回事，但看到它就在你面前是另一回事。多年来，显微镜捕捉到的色彩鲜艳的斑点和摆动的轮廓启发了许多崭露头角的科学家。似乎他们也启发了今年的诺贝尔化学奖委员会，因为该奖项被授予Stefan地狱，Eric Betzig而且W E莫尔纳．这三位超分辨率显微镜的先驱使人们能够以前所未有的细节窥探活的、会呼吸的细胞。现在，基于他们发现的方法正在世界各地被用于放大纳米宇宙并揭示其内部工作原理。

这不仅仅是拍漂亮的照片。黑尔说:“最终，每一种疾病都会导致细胞层面的某种紊乱。”黑尔在德国马克斯·普朗克生物物理化学研究所(Göttingen)工作。“只有当我们能够深入细胞内部，我们才能确定到底是哪里出了问题。”

一个多世纪以来，光学显微镜——观察活细胞和组织的常用方法——只能用于观察光波波长的一半以下的结构，或大约200纳米，这是19世纪晚期科学家发现的限制恩斯特阿贝．虽然电子显微镜可以提供更高的分辨率，但它要求样品在低温真空下制备，因此不适合生物。

通过挑战并最终克服阿贝的极限，赫尔、贝齐格和莫尔纳打开了通往一个充满可能性的全新世界的大门。

支持基础知识

对于赫尔来说，他最初怀疑阿贝的衍射极限可能被打破时，他还是德国海德堡大学的一名博士生。这种预感一直在他的脑海中萦绕，直到20世纪90年代，他对如何实现这一目标形成了更具体的想法。“我知道我必须进入分子内部，”赫尔说。“我不能用光来做这件事——不可能改变光。”

他的想法是，如果你能找到一种方法，把一个光源发出的光(比如一组荧光分子)全部关闭，只保留一小块纳米大小的区域，你就可以摆脱会产生模糊的光，并获得更高的分辨率。在芬兰完成博士后工作后，赫尔回到德国继续研究这个想法，并在20世纪90年代中期发表了他关于如何克服极限的第一个理论建议。

他的发明是受激发射耗竭显微镜(Sted)，它使用两个激光源——一个窄光束激发一个微小点上的荧光分子，另一个空心管形状的光束熄灭该点周围的所有荧光。然后，每次扫描一个纳米宽的条带，以建立一个高分辨率的图像。又过了五年，赫尔才真正演示了Sted，用它来观察荧光斑点，这些荧光斑点远远小于传统衍射极限。¹

与任何挑战教科书观点的研究一样，他的工作受到了更广泛的科学界的批评。赫尔回忆道:“一开始他们说这在原则上行不通。”“当它在原则上起作用时，他们说也许只有在特殊情况下才会起作用。当它在特殊情况下起作用时，他们说它在生物体中不起作用……等等。但他并没有让自己被吓倒，而是一步步地证明那些批评人士是错的。他说，因为我知道这个想法从根本上是正确的，所以我坚持了下来，当别人告诉我这个想法行不通时，我不允许自己被误导。他补充说:“有一些问题必须克服和解决，但它们不是最基本的，这就是我相信它的原因。”“技术问题和基本问题之间有很大的区别——基本问题可能会保留;技术问题是可以克服的。

这种决心显然得到了回报。自Sted首次被证实以来，在相对较短的时间内，这项技术已经被生物医学领域的所有研究人员所采用。Sted显微镜——目前全世界只有少数几种——最近被用于监测神经细胞内肌动蛋白纤维的行为，跟踪收缩的心脏细胞内离子的运动，并研究dna结合蛋白的组织。今年，赫尔的团队发布了他们用于生物医学研究的Sted显微镜的最新设计，²能够达到20nm的分辨率。

黑尔说:“图像模糊已经没有意义了。”他的团队继续改进Sted技术，致力于进一步推动解决的边界，并与他人合作，将这些技术应用于不同的问题。“这太有趣了!”他说。

单一的杰出人物

当赫尔把他的理论整合在一起时，贝齐格和莫尔纳为另一组克服阿贝极限的技术奠定了基础。虽然Sted通过猝灭发光荧光分子发出的光来工作，但这些依赖于控制分子本身的行为。最早的突破之一是莫尔纳在1991年成为第一个检测到并五苯的单个荧光分子的人，他使用基于激光的技术来测量它吸收的光。^3.

“在那之前，没有人关注或关心单个分子的性质，他们关心的是整体。史蒂文•李他是美国斯坦福大学莫尔纳团队的前博士后研究员，目前在英国剑桥大学工作。

接下来的一大步是跳到室温

W E莫尔纳

当时，莫尔纳并没有考虑显微镜或细胞生物学，而是在研究IBM的阿尔马登研究中心在美国圣何塞，他正在探索光学存储信息的方法。他不知道他的测量结果会引发显微镜学的革命。莫尔纳说:“但我知道我们会看到惊喜，因为我们之前只是没有测量过。”他必须在4K的温度下进行单分子检测实验。他说:“接下来的一大步是跳到室温。”

这是贝齐格的工作AT&T贝尔实验室在20世纪90年代中期实现，使用一种称为扫描近场显微镜的技术，在室温下对碳菁染料的单个分子成像。

他还开始思考如何利用单分子检测来实现超分辨率。在这一点上，单个分子只能在室温下被稀释到纳摩尔水平时被检测到，并且分散得足够远，以防止它们发出的荧光信号重叠。这显然不利于对高浓度细胞中分子的成像。

但是Betzig认为，如果可以用不同颜色的荧光分子来标记样品——每个荧光分子以低密度分布在样品中——显微镜就可以依次定位每种颜色的所有分子，图像就可以叠加得到完整的图像。

贝齐格在1995年发表了他的理论，⁴但当时还没有办法将其付诸实践，因为具有正确光学性质的分子并不存在。后来，他决定暂时停止研究，从贝尔实验室辞职，到他父亲的机床企业安娜堡机器公司(Ann Arbor Machine Company)担任研发副总裁。

看手相

与此同时，单分子光谱学作为一门学科继续发展。在贝齐格发表他的观点两年后，当时在美国圣地亚哥加利福尼亚大学工作的莫尔纳有了一个非常重要但有点偶然的发现。研究绿色荧光蛋白分子(GFP，这一发现本身就获得了2008年的诺贝尔化学奖;看到发光的绿色诺贝尔奖)，该小组发现，当用单分子显微镜中的激光束激发时，绿色荧光蛋白会“闪烁”。在最终褪色之前，这种蛋白质经历了几个荧光和黑暗的循环。此外，荧光可以通过改变光束来开启和关闭——在405nm处照射暗分子可以重新激活它们。莫尔纳说:“我们只是没想到在室温下能看到如此有趣的光动力学。”“这太令人兴奋了。”

这种开启和关闭荧光分子的能力为区分细胞等浓缩介质中的单个分子提供了可能——分子不必在空间上分离或通过发出不同颜色的荧光来分离——它们可以在不同的时间被激活。看到Moerner和其他人在GFP方面的工作足以吸引Betzig回到这个领域。他和朋友一起离开了家族企业哈拉尔德赫斯他是贝尔实验室的前同事，也失业了，他开发了光激活定位显微镜(Palm)，在赫斯位于圣地亚哥的公寓里建造了第一个原型设备。

他们得到细胞生物学家的帮助詹妮弗Lippincott-Schwartz在贝塞斯达的美国国立卫生研究院，他开发了一种突变的绿色荧光蛋白，最初存在于“关闭”状态，但可以通过488纳米的照射使其发出荧光，最终使其不可逆转地变暗，这种现象被称为“光漂白”。这使得样本中广泛分散的一组分子被激活，定位和成像，然后沉默，这个循环可以一遍又一遍地重复，以建立所有分子的完整图像，并以远远高于阿贝极限的分辨率显示图像。Palm技术的第一次演示出现在2006年，当时它被用于成像整个细胞和亚细胞结构，包括用荧光蛋白标记的线粒体。⁵

同年，另一个由晓伟壮族哈佛大学的研究人员开发了一种叫做随机光学重建显微镜(Storm)的技术变种，这种技术使用的荧光花菁染料可以可逆地开启和关闭。⁶

除了生物学

今天，Sted、Palm和Storm等方法为细胞和分子生物学家提供了细胞内部的纳米级视图，而不受电子显微镜的限制。利平科特-施瓦茨说，这些技术“彻底改变了我们对活细胞的一些最基本概念的认识，这些概念到目前为止一直被隐藏”。她在美国国立卫生研究院的团队继续使用超分辨率成像来研究蛋白质如何在不同的细胞结构上组织自己，包括致病细菌和病毒的细胞结构。她说:“这些技术甚至可以用来识别埃博拉病毒的独特特征，从而帮助找到消灭它的新方法。”betway必威游戏下载大全

莫尔纳还与他目前在美国斯坦福大学的研究基地的同事合作，研究细胞的内容。他的团队露西·夏皮罗曾使用单分子光谱学来研究细菌中参与细胞分裂的蛋白质的组织，他还与朱迪思·弗莱德曼的在实验室观察与亨廷顿舞蹈症有关的蛋白质聚集，这种方法可能为治疗提供新的靶点。

米歇尔Orrit荷兰莱顿大学的另一位单分子光谱学的早期先驱指出，该领域也有很多可以提供给其他研究领域的东西。他说:“这次诺贝尔奖只展示了一个方面:成像。”他的团队和其他许多团队正在将单分子光谱学应用于生物物理学、量子光学和材料科学等领域。他说:“例如，我们的团队一直在研究玻璃的形成，以及粘性液体是如何溶解的。”“你也可以开始在更详细的基础上理解催化，或者分子是如何在纳米管中扩散的。通过这种方式，你会更加意识到你的材料的质量。”

随着这些技术变得更快、更便宜、更友好，越来越多的人开始使用它们。“这种现象非常普遍。如果你和大多数人交谈，无论他们的背景如何，他们都会听说过超分辨率成像。”

他补充说:“他们现在可以使用这些工具了，代码变得更加自动化，而且比过去更加健壮。”他说，这为许多以前无法真正提出的基本问题打开了大门。

对于一个发展如此迅速、与技术进步和用户数量增加密切相关的领域来说，很难看到接下来会发生什么。

黑尔说:“我们有广阔的竞争空间。”“不同类型的光学显微镜都有非常不同的特点——有些非常快，有些非常灵敏，有些非常准确。这在未来会有更大的改善。”

开发这些工具的人继续追求越来越高的分辨率。李安说，这是一个非常令人兴奋的领域。“基于定位的工具(如Palm和Storm)的分辨率受到荧光团中光子数量的限制——目前，我们发现必须开发更好的染料来提供更多的光子。”

Moerner说，对超分辨率成像能力的不断改进将使科学家能够解决日益复杂的问题。“有很多有趣的系统可以研究。我们将继续在一切可能的地方开拓新领域。”