重新设计自然的催化剂

酶是molecule-making大师。自然优雅的答案催化进行不同的转换,令人眼花缭乱的选择性和特异性,我们往往只知道。

而不是试图与这样的性能,合成化学家们正越来越多地拉拢。利用酶催化的反应,不过,这听起来可能不是简单的解决方案。

的性质做了出色的工作在一个非常复杂的阿森纳的催化剂,但不是自然任何化学反应的催化剂,化学家和生物学家可能促进,”唐纳德Hilvert说,发展生物催化剂在苏黎世的瑞士联邦技术研究所(ETH)。在过去的10 - 15年,但是,该领域的研究人员已经开发出一种日益复杂的一系列工具来重新设计酶,调整其特异性的反应问题。

“这整个领域已经很明显在过去的几年中,“尼克•特纳说卓越中心主任生物催化、生物转化和Biocatalytic生产在曼彻斯特,英国。仍有巨大的发展在学术社区,但我们认为这些工程酶在工业上的应用程序现在。”¹

随着酶催化的力量变得清晰,发展的步伐加快,特别是行业已经开始认真的兴趣在过去两到三年,特纳补充说。每个生物催化剂,开发商业应用程序现在可能已经通过蛋白质工程阶段。越来越多的酶是工程实际应用。

该领域的最新进展是去年7月成为关注焦点,由一对的论文出现在同样的问题科学。计算化学的一篇论文显示非凡的潜力与全新设计酶功能未见。²但是其他论文可以说是更重要的。³

工业需要

Sitagliptin中的活性成分是2型糖尿病药物Januvia,由美国制药公司默克& Co .)的大规模生产的最后一步Sitagliptin涉及酮转换为手性胺,麻烦步骤涉及rhodium-catalysed中间烯胺的不对称氢化。转换的立体选择性是不够的,需要更多的净化步骤移除铑。

默克的雅各布·詹尼解释说,渴望改善sitagliptin制造并不是唯一原因公司决定投资的时间试图开发一个biocatalyst-based替代铑反应。在默克公司我们有确定的变换一个手性胺酮的关键技术,我们认为值得发展中,不仅sitagliptin作为一般方法,”詹尼说,高级研究化学家的法律基础,新泽西,美国。因此我们把这个初始开发化学风险。”

默克公司的研究人员曾与酶专家Codexis搜索biocatalytic回答这个问题。引人注目的这项研究,科学家们赢得了美国环境保护署的一个2010年总统绿色化学挑战奖,长度,团队不得不去为了发展一个活跃的氨基转移酶生物催化剂。他们开始的酶,这种酶是一个已知的氨基转移酶,但其活动对默克的起始分子基本上是零——衬底太大以适应在酶的活性部位。

从零到英雄

重新设计这样一种酶,你从哪里开始呢?酶是蛋白质,氨基酸长链折叠形成一个三维结构,在形成活性口袋里被称为活性部位。适应新底物酶意味着开关在一些个别氨基酸——口袋的形状来适应变化。

但开关吗?快速浏览一下这些数字显示的程度的挑战,Hilvert说。小蛋白,说100个氨基酸,有20^{One hundred.}不同的同分异构体,我们不能看所有这些——这是比宇宙中有更多的原子。甚至很难观察这些可能性的一小部分。

传统上,开发了两种不同的方法来处理这个问题。合理的设计故意目标特定的氨基酸在蛋白质结构。但预测蛋白质的氨基酸序列的变化会影响它的三维结构是出了名的困难。另一种方法是使随机突变,并使用大规模筛选选出最好的一个。这个最佳候选人可以被进一步轮诱变,挑选最好的例子从每一代,所以逐渐进化酶的结构。这是一个方法称为定向进化。

越来越多,最有效的方法是使用一个混合的两种方法——sitagliptin的情况。该团队使用计算模拟酶的映射绑定的口袋,识别两个地区,需要调整适合的基质。然后使用定向进化针对氨基酸衬里绑定的口袋里,在两个有问题的区域。

整个活动的艰难的部分发展中最初的活动——从零到一些东西,”詹尼说。我们应用基质行走方法使酶底物,我们工作很感兴趣。行走的衬底包括最初进化酶与简化,截断衬底,反应的酶已经有限。经过几轮的突变,一旦第一个问题区域的活性部位已经打开了一点,他们可以切换到真正的底物开发的第二个方面。

更少的浪费,更多的产品

总之,Merck-Codexis团队把酶通过11轮的进化,使得原酶27个人突变。所有这些工作的好处是显而易见的。原rhodium-catalysed路线相比,总收率提高了10%,产生的浪费过程下降19%,重金属是消除和成本降低。我们目前在验证的过程中使用的新化学在我们的商业sitagliptin制造业务,”詹尼说。

像这样的例子,使行业认为潜在的好处是值得的。“这真的出版引起了人们的想象力,”特纳说。他们不仅改变了底物特异性,也改善了酶的稳定性对于流程应用程序,这显然是很有吸引力的行业。”

特纳与工程酶应用自己的工作来提高药物合成。去年,他发表了他的团队的合作结果Romano Orru荷兰阿姆斯特丹VU大学,专攻多组分反应。⁴这些反应剪辑在一起三个或更多分子开始在一个步骤中,所以提供快速访问复杂的化合物。然而,这样的反应往往是缺乏立体选择。但控制立体化学是生物催化的关键优势之一,把两个在一起是一种非常有效的方式使分子,特纳说。

仿制药公司生产低成本复制的药品专利保护期满后,当然是开始注意的工程酶。很多大的药物了专利,或将在未来几年内,所以仿制药公司真的做好准备,”特纳说。他们计划多年前确保他们有新的注册路线可用当分子脱离专利。他们已经开始感兴趣的生物催化-再次,在某些情况下,它可能是一个低成本的选择。一旦事情成为通用的,成本非常关键。”

以前没有酶哪里吗

这些方法都很好利用的化学性质已经使用。但是没有此类等价的反应吗?Diels-Alder反应,说,这是一个最有力的方法合成化学家设计了构建复杂分子结构?

对论文的第二个科学表明,有一种方法,但也说明了挑战的规模。大卫·贝克在西雅图华盛顿大学的我们,和他的同事开发了一个功能“Diels-Alderase”——一种酶,这种酶结合两个基板在正确的方向进行Diels-Alder反应,形成两个新的碳碳键生成一个新的六元环。

我们工作了很长一段时间的问题计算蛋白质结构的序列,设计蛋白质结构是一样的从另一方面的,”贝克说。催化是其中一个最令人印象深刻的功能,自然蛋白质,所以设计新的催化剂是一个明显的挑战。

第一步是计算反应的过渡态的形状,然后设计理想的活性部位,以适应和稳定。在设计过程中,活性部位只是一群的氨基酸,放置在一个方式,有望促进反应。这部分由化学直觉比任何事情都做得更多,”贝克说。设计的最后一步是一步,你试着构建的蛋白质折叠持有所有这些官能团在理想的位置在过渡态”。

最后一步,贝克的团队使用他们开发了一个计算机模型,称为罗塞塔,在大分子原子模型之间的交互系统。他们搜查了一个数据库的稳定蛋白质支架为那些有权利的几何嫁接设计活性部位。

这个过程生成80潜在的蛋白质合成和测试。50的酶溶性,其中,两个显示出催化活性。这些都进一步提高了site-selective诱变。由此产生的催化剂具有高度substrate-specific、高立体选择——但不是非常快。

在科学方面,工作实在是太出色了,”特纳说。“不是许多实验室能做他能做的事。但把它在地图上的绝对的活动,还有一段路要走到酶的活动,从自然资源中。”

Hilvert也参与该项目,同意设计前还有一段路要走接近酶的催化性能。计算设计是一个非常有前途的工具,未来,以及取得了重大成就在过去的几年里,”他说。Diels-Alderase不是最终的答案,但它表明应该是可能的。”

贝克已经在下一步工作。“我们现在大力推动提高我们的成功率,所以不用测试80(结构)2(活跃的酶),我们想测试80 - 80。我们想增加蛋白质的活动设计,通常很低。”而不是必须转置设计活动网站上现有的支架,团队工作的一件事是从头开始设计一个脚手架在地方举行一切完全反应,他补充道。

同时,计算将继续重组酶的工业应用中扮演着重要的角色,只是更多的计算由默克和c公司。我最看好的是相结合的可能性计算与实验进化序列空间的搜索,搜索“Hilvert说。计算给你开始的平台你可以进化出新的活动。我认为那里有巨大的承诺。”

然而,Hilvert也看到另一个令人信服的理由在这方面继续推进,充分理解自然酶本身。“真正加速反应的酶-数量级。当你试着模仿你捕获的一小部分,问题是,酶在哪里最后几个数量级,是什么令她们如此的特别?我不认为我们理解。所以想设计新催化剂,对手自然酶的效率将希望教我们关于我们需要采取的步骤复制这些奇妙的效率。

詹姆斯·米切尔乌鸦是一个基于自由科学作家在墨尔本,澳大利亚