Crispr从利基诺贝尔如何

生化历史上最大的一次合作开始在圣胡安在咖啡馆,波多黎各。那是2011年,Emmanuelle贝纳和詹妮弗Doudna参加一个微生物学会议上,有一个小会议致力于一个名不见经传的研究领域:集群定期中间短回文的重复序列,简称Crispr。九年之后,两人分享了诺贝尔化学奖。

虽然两位科学家不知道彼此,他们决定一起去探索这个城市后跑到对方在一家咖啡馆。我们走在老圣胡安的街道和谈论Crispr-Cas9以及如何将是非常有趣的找出它可能在细菌,”Doudna召回上周的一个新闻发布会上。发现了几年在他们相遇之前,Crispr-Cas是一个古老的细菌的免疫系统的一部分,检测和排入侵病毒的DNA。

尽管贝纳和Doudna没有计划除了发现这个鲜为人知的生化机制系统,他们有一种感觉,到大的东西。在一年内意外的会议上,将会显示如何编程Crispr-Cas9非常精确的任何活细胞的DNA——工作,科学有了翻天覆地的变化。¹

没有其他工具,如此革命性的科学家手中的[和]在他人的生命,如此之快,”说海伦奥尼尔工作,他在伦敦大学学院Crispr,英国。八年自成立以来,已经有爆炸的研究活动,现在看到的出版物的话题出来每一天。多家公司已经成立仅仅开发和商业化的技术。

遗传剪刀已经用于生产blemish-resistant蘑菇与更长的保质期,突变体可以传播疟疾的蚊子通过野生种群和阻力猪的器官能够被移植到人类。Crispr-Cas可以治疗血液癌症和治疗遗传疾病如先天性失明或血友病。

没有其他的工具,如此革命性的科学家和其他人的生命,如此之快

不同于几十年的基因治疗的概念,试图抵消额外的突变,健康的基因,基因编辑可以完全删除或替换一个疾病的DNA。在早期的临床试验,Crispr-edited细胞消除另一个遗传疾病的症状,镰状细胞贫血。从它的转变作为一个研究工具实际上是一个医学就像陨石击中地面,”奥尼尔说。

和技术仍然是用于创新的方法。就在几周前,一个大型团队,包括Doudna,为首梅勒妮奥特格莱斯顿研究所的病毒学与免疫学在旧金山,我们表明,他们可以检测Covid-19在五分钟内使用Crispr-based测试和移动电话。²

开发基因剪刀,贝纳的德国马克斯普朗克单位科学的病原体,Doudna,加州大学,伯克利分校在美国,现在已经被授予2020年诺贝尔化学奖。但了解他们设法把Crispr从一个相对模糊的细菌免疫学领域的一个世界性的现象,我们必须回去几乎三十年。

从细菌开始

在1993年,旧金山Mojica,那么大学的博士生在西班牙阿利坎特,遇到一些意想不到的嗜盐微生物的基因组:重复,回文的DNA片段分离短间隔序列。很明显,这些基因是活跃和重要的细胞,但Mojica不知道他们是什么。在文学,他发现了1987年的一篇论文描述相似的重复DNA模式大肠杆菌。³

经过多年挖掘出版物和检查原核基因组,Mojica意识到这些奇怪的重复单位普遍在微生物——甚至是那些远离彼此的进化树。这表明,基因为一个重要的目的,因为他们一直保存在数百万年的自然选择。Mojica, 2002年通过信件与乌特勒支大学的分子微生物学家路德詹森在荷兰,创造了缩写Crispr:集群定期中间短回文的重复序列。⁴

但Crispr实际上做了什么?仍然是一个谜,直到Mojica发现噬菌体的间距器匹配的DNA序列,一种感染细菌的病毒。的基因,他推断,必须是一个未被发现的系统,帮助一部分细菌抵抗感染。

科学界是怀疑。Mojica的研究提出一个细菌的免疫系统被拒绝了由四个不同的期刊,直到他终于在2005年出版。⁵慢慢Mojica出版后的几年里,研究人员开始拼凑完全这个防御系统是如何工作的。隔离区域从噬菌体基因剪报,纳入一个细菌的基因组后,病毒感染。在随后的感染类似的噬菌体,用于识别和摧毁病毒DNA片段。

Crispr序列首先被转录成RNA分子,然后沿着重复部分切成小Crispr-RNAs (crRNAs),每个都包含一个垫片和部分重复。几个Crispr-associated (Cas)蛋白质是负责这个激活的过程。Cas蛋白质附着在crRNAs,使用它们作为指导寻找互补的病毒DNA。一旦匹配被发现,Cas削减双链DNA噬菌体。

但仍有一个缺失的难题。许多细菌没有多机械产生crRNA片段,他们只有一个单一的蛋白质——Cas9。必须有另一种激活途径,贝纳在2011年发现的。

进入贝纳

贝纳来到Crispr研究在2000年代末。他刚从奥地利维也纳大学的在瑞典北部于默奥大学,她学习酿脓链球菌,导致扁桃体炎的细菌和浅表皮肤感染肺炎和败血症危及生命。贝想知道如何和其他微生物产生抗药性的通过观察小,基因调控RNA分子。

与总部位于柏林的分子微生物学家Jorg沃格尔,贝纳的团队已经映射的链球菌的小rna。一个品种脱颖而出。它显然是重要的,因为它存在于大量,但是没有知道它。坐在靠近的团队发现其编码基因链球菌的Crispr序列,暗示某种连接。

这是一个美丽的故事,非常意外的,蓝色的

实验删除不同的基因,看到这是如何影响微生物的能力抵抗噬菌体证明这些trans-encoded小rna - tracrRNAs过程的一个重要组成部分。TracrRNAs帮助生成活跃,virus-destroying RNA-Cas复杂。他们绑定到重复部分的RNA链Crispr最初生成的基因。Cas9承认这种RNA双结合,引发由核糖核酸酶酶裂解成小块创建主动crRNA-Cas9系统。

贝纳沃格尔和他们的团队发现了失踪的激活途径,基于tracrRNA和crRNA之间的交互。这是一个激进的想法——rna不知道是团队球员,不像蛋白质,经常在一起工作。

经过一年的整理证据支持这一假说,贝纳沃格尔和他们的团队在2011年发表了研究结果。⁶贝纳在荷兰Crispr会议上也提出了他们。这是会议的一大亮点,一个美丽的故事,非常的意外,蓝色,”微生物学家和会议组织者John van der东说2016年的采访中自然。

贝知道她可能将要发生什么大,但是她需要一个结构生物学家的帮助。所以她参加2011年波多黎各微生物会议计划。我所想要的方法詹妮弗和问她是否会破译Cas9的结构感兴趣,”贝纳解释说采访Crispr日报去年。

尤里卡的乐趣

“当我刚开始工作,我认为它是一个有趣的小项目,“Doudna说最近的一次采访中与美国国立卫生研究院(NIH)对她的首次涉足Crispr研究早在2006年。伯克利分校的同事,微生物学家吉莉安班菲尔德,告诉她关于神秘Crispr序列。Doudna很感兴趣。但涉足Crispr研究也使她感到有点内疚,她说。我从美国国立卫生研究院资助,霍华德健康医学研究所,我想:我怎样才能真正证明这个疯狂的小细菌免疫项目可能与人类健康零?”

10年前,Crispr是一个相对模糊的领域。社区是如此之小,每个人都可以适应一个会议室。那时候,如果我想去某个地方,说“我在细菌的免疫系统”我非常困惑的表情,“为什么你会这么做吗?“Doudna在回忆道上周伯克利新闻发布会。

波多黎各在2011年的会议上,专用于Crispr只有单个会话。贝纳和Doudna呈现在这个会话。尽管他们知道彼此的工作——当时,现场的每个人都知道每个人的工作——他们没有亲自见过。

但是当他们开始说话,他们很快意识到他们的互补的科学知识。我们来到Crispr字段来自完全不同的背景,“Doudna告诉必威体育 红利账户。“她是一个微生物学家,通过培训和集中在细菌对人类是有害的。我的研究一直集中于分子,特别是RNA和试图理解它的作用在生命的进化。”

在2017年的一次采访中,《卫报》,Doudna回忆贝纳的传染性的兴奋。即使这样我就有这种感觉,这是很有趣的。“一旦两人在各自的实验室——Doudna和她的团队在美国西海岸,贝纳和她的小组分离瑞典和奥地利——他们开始一起工作。

“有很多电子邮件,Skype通话和发送东西来回穿越大西洋,“回忆道马丁Jinek,然后Doudna集团的一位博士后研究员共同第一作者在2012年的开创性研究。末的研究中,它成为了一个昼夜操作”,Jinek解释说,由于时差三个实验室。

“短暂而强烈的合作,”贝纳说诺贝尔基金会的采访奖后不久宣布。“我们明白,合作很重要,我们需要去快,因为这个故事是一个伟大的人。”

但首先,实验不工作。纯化Cas9蛋白和一张crRNA精确地什么也没做。“我们认为我们的所有组件,但DNA并没有减少,“Jinek告诉必威体育 红利账户。然后,当我们说tracrRNA进入混合,突然,事情开始工作。对我们来说,这是一个大的时刻。tracrRNA,事实证明,不只是激活系统中发挥作用,也需要其平稳运行。

根据定义,Cas9是一个可编程的酶:是使用不同的RNA识别DNA序列,“Doudna解释道。然后我们意识到,我们可以设计一个指导RNA为编程Cas9工作。”

这正是他们所做的。他们融合crRNA和tracrRNA到单个分子——20个碱基对序列现在叫指导RNA。当单个分子一样有效地工作,团队意识到,他们已经创建了一个系统,将削减DNA无论他们想要通过改变RNA模板——一个念头。马丁是在我的办公室,我们在谈论他的数据,我们互相看了看,发现这可能是一个非凡的工具在其他类型的细胞,因为它能够引发DNA修复,从而使基因组编辑、“Doudna回忆在伯克利新闻发布会。

这个想法是革命——对某些人来说可能太革命。在大致相同的时间,贝纳Doudna和他的同事致力于出版他们的结果,领导的一个团队VirginijusŠikšnys立陶宛维尔纽斯大学还显示,Cas9系统可以减少DNA序列在预定的位置。Šikšnys送纸细胞,在那里被拒绝了没有审查。花了几个月,直到它终于接受不同的杂志。⁸贝纳和Doudna有更多的运气,他们的开创性的研究是接受科学。¹

我们提出了结果接近Crispr会议刚出版的时候,兴奋是巨大的,”说Krzysztof Chylinski在纸上,另一个共同第一作者,他是一个博士生在贝纳的小组在维也纳。而基因工程不是新的,Crispr-Cas将允许科学家操纵DNA的一个全新的水平精度而使过程更简单、更快、更便宜。

从年个月

人们开始思考基因组工程的时间当他们意识到DNA是生命,有一个代码,”说Audrone Lapinaite最近完成了博士后奖学金在Doudna的实验室,现在使用的是一个研究小组在美国亚利桑那州立大学。Crispr发表时,有两个基因组编辑领域的主要参与者:锌指核酸酶和转录activator-like效应核酸酶(取得)。

这两个系统的最大问题是,它并不是那么容易的目标他们特定的基因组序列,因为你不得不重新设计蛋白质找到感兴趣的基因的位置并执行切割、“Lapinaite解释道。的工程都是需要花费很多努力,这不是微不足道的。Crispr,大突破是蛋白质总是相同的,你可以很容易地产生许多。”

Crispr之前,奥尼尔说,“我花了两年——这是一个伟大的成就——两个转基因小鼠。现在,可以在几个月内完成。“科学家们现在只需要生成一个定制的RNA分子-常规过程相匹配的DNA序列他们想要的目标。

唯一限制在任何地方自由切割DNA的存在是protospacer相邻主题(Pam)附近的一个短的两到六个碱基对序列目标序列。Pam对Cas9承认其目标很重要。它阻止细菌DNA切割自己的Pam他们使用特定于噬菌体。但由于从不同的细菌种类识别不同Pam Cas蛋白质序列,这个限制也慢慢消失。

Crispr-Cas9系统只能减少双链DNA,但不会改变。会发生实际的编辑之后,依赖于细胞的修复机制。细胞修复DNA通过直接融合断头,通常删除或插入一个碱基对,关掉一个基因的功能。

细胞在不同的过程中,寻找一个同源修复DNA序列作为一个模板。研究人员可以利用这种机制来插入或修改的序列通过提供细胞DNA模板小碎片。自修复机制只存在于细胞分裂,编辑非区分细胞的基因,例如,神经元仍然具有挑战性。

这个想法传播

什么对我来说是一个巨大的迹象是什么会是,半年内,冯张和乔治教堂表明,我们提出的是工作的确,Chylinski说。首先,目前还不清楚指出Crispr-Cas9是否工作在无菌细胞。一个最初的想法是简单地使用系统,使细菌更phage-resistant,这本身是一个巨大的恩惠生物技术。但张,教堂和Doudna自己很快发现,没有这些限制Crispr-Cas9,证明遗传剪刀在老鼠和人类细胞一样工作。^9、10、11

在接下来的几年里,这一领域经历了一系列的活动,没有丝毫减弱的迹象。我们没有欣赏有多少饥饿是社区的工具,可以很容易适用,“Jinek说。一些科学家开始修改农作物提高抵抗疾病和害虫。其他工程小鼠和大鼠作为人类疾病模型,虽然许多跳上解决遗传疾病的可能性。

但能够如此轻松地编辑基因组和精度也意味着很可能改变生物体的生殖系,这意味着细胞将遗传物质传递给后代。这是第一次证明了¹²2014年在猴子,然后一年后在不可行的人类胚胎。¹³

人类生殖系的变化,如果采取的足够远,真的会改变人类进化的过程中,“Doudna在美国国立卫生研究院的一次采访中解释道。”我发现自己很多个晚上睡不着思考潜在的这种技术,我参与开发利用以这种方式,”她说2019年基因编辑的谈论未来。自2014年以来,她一直公开提倡使用基因编辑负责。

的伦理难题

但是在2018年11月,Doudna收到邮件的标题“婴儿”。它来自他Jiankui,南方科技大学的生物物理学家(SUSTech)在深圳,中国。在一个非常简短的邮件,他告诉我他已经参与临床研究,他们用Crispr-Cas9改变婴儿的基因组已经出生,”她回忆说在2019年的讲话。

这是非常,非常重要的,国际社会强烈反对Crispr的不计后果的使用

几天后,Jiankui公开宣布他已经扰乱了CCR5基因,使艾滋病毒感染细胞,双胞胎女儿。这显然是为了保护婴儿免受病毒,因为他们出生一个hiv阳性的父亲。虽然自然CCR5突变确实提供了一些艾滋病毒保护,基因编辑是不同的,甚至从来没有在动物身上进行测试。

“我非常震惊,”Doudna告诉必威体育 红利账户。“我知道这是会吸引大量的关注,这是非常非常重要的,国际社会出来的强烈反对,不计后果地使用技术,不是人们的健康负责。”的确,科学界Jiankui受到严厉谴责的行为,2019年12月,他被判处有期徒刑三年非法医疗实践。

丑闻将基因编辑到了聚光灯下。公众的认可冷却后,越来越多的人担心这项技术比兴奋的可能性。这也影响的研究社区寻求帮助防止毁灭性的遗传疾病的人将它们传递给他们的孩子。这是像我这样的人,他真正的诚实的意图治疗,到目前为止,它实际上是相当可怕的,”奥尼尔回忆说。

在同一时间,有很好的协调一致的全球努力确保我们不会再见到这种不计后果的使用”,Doudna说。不仅国家,全球需要讨论,Lapinaite说。去年,世界卫生组织推出了一个注册表来跟踪人类基因组编辑活动。

进步尽管专利纠纷

更积极,Crispr研究首次临床成功的故事。去年,维多利亚灰色成为第一个人遗传条件-镰状细胞病治疗Crispr-based疗法在美国。她收到了一个包含大约二十亿自己的骨髓移植细胞,编辑在胎儿切换haemoglobin-producing基因来弥补她的成人血红蛋白基因缺陷。尽管为时过早完全评估治疗的成功,灰色已经停止经历的极度的痛苦,这是典型的条件,并不再需要输血。

有一个巨大的驱动开发Crispr等临床应用还一个生物医学工具。贝纳和Doudna都成立了多家初创企业专注于商业化的技术。

但是,急于让Crispr-Cas也引发了市场一个相当复杂的专利纠纷一边的两个奖获得者和伯克利分校和张Broad研究所。尽管伯克利早些时候申请专利——使用Crispr-Cas9无细胞系统广泛的使用真核细胞中的技术专利是第一。到目前为止,两项专利已经被允许保持并排站着,但争议还在继续。

与此同时,在许多方面都推动。的一个挑战是交付Crispr-Cas成特定的细胞。传统上,介绍了整个系统作为一个编码DNA片段,使细胞产生自己的Cas9蛋白质和RNA。然而,这洪水大量Cas9蛋白质的细胞,增加日常活动的机会。科学家已经开始测试病毒样颗粒是否能注入完全组装指南RNA-Cas9复杂的细胞。这允许更好地控制ca蛋白/细胞的数量,甚至目标特定的细胞类型取决于病毒颗粒的受体。

研究人员也在探索Crispr-Cas变化,¹⁴一些不同的活动RNA-cutting或长串攻击,例如。最新的峰值精度是DNA基础编辑、修改中科院生化反应的酶单一碱基对转换成另一个没有切割DNA链。这可能有助于治疗基因点突变引起的,如条件儿童的早衰症。

和人们不断发现新的Crispr-Cas系统。Doudna集团最近描述了一个小CasΦ他们发现巨大的噬菌体。¹⁵这些细菌病毒往往Crispr系统自己的,杀死其他病毒争夺相同的主机,”解释道部队Al-Shayeb,这项研究的第一作者。虽然只有一半大小的Cas9, Crispr-CasΦ系统一样的功能。和小可以更容易进入细胞,Al-Shayeb补充道。

从合作到庆祝活动

2012年合作后,贝纳和Doudna利益分化。的Emmanuelle渴望继续在细菌真的关注途径导致人类疾病,“Doudna解释道。”,在我自己的工作,我们挖到Crispr的分子机制。

然而,两个留在Crispr热潮的中心和养尊处优备受瞩目的奖项,包括300万美元(£230万)突破奖在2015年生命科学,纳米科学的100万美元2018年Kavli奖(两人与Šikšnys共享)和100000美元的2020年狼医学奖。在2015年,时间杂志命名他们100位最有影响力的人物之一。

贝纳和Doudna也经常把诺贝尔奖和领导的预测调查了好几年。一样是说科学家和非科学家Crispr-Cas会获得诺贝尔奖有一天,我们还不清楚,”贝纳说后的新闻发布会上宣布诺贝尔。“我非常情绪化,当我接到电话的。”

而贝纳接到她的电话从斯德哥尔摩坐在她的办公室在柏林,Doudna是不那么传统的警钟。2.53我在加利福尼亚和她的手机嗡嗡作响。“这是海蒂Ledford,自然记者我跟过去,“Doudna告诉伯克利上周媒体团队。Ledford想评论诺贝尔奖。“我以为她打电话来问我评论别人获奖。所以我问她:“谁赢了?”,她说:“好吧,你!”

贝纳和Doudna强调Crispr就是一个完美的例子如何解决方案来自意想不到的地方。这不是做科学为了出版和积累的影响因素,而是相信一个可能不是令人兴奋的项目或时尚,”贝纳在新闻发布会上说。

2020年的化学奖也第一次去一个全由女性组成的团队。这对我意味着很多,回想自己的童年,“Doudna伯克利团队说。“成长的过程中,我被告知,多几次,女孩不做化学。在诺贝尔的新闻发布会上她补充说:“我认为对许多妇女有一种感觉,无论他们做什么,他们的工作永远不会被视为可能是如果他们一个人。我想看到变化,我认为这是一个正确方向的一步。

但Doudna最兴奋的是专用停车位,伯克利储备诺贝尔奖获得者。'现在我可以最后,18年后,公园在校园,”她笑了。